Kromatografi, Prinsip Teori High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu senyawa yang didasarkan pada perbedaan distribusi dari komponen-komponen dalam suatu senyawa diantara dua fase, yaitu fase gerak (cair atau gas) dan fase diam (padat atau cair).

Perlu untuk dicatat!

  • Bila fase diam berupa zat padat yang aktif maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography).
  • Bila fase diam berupa zat cair, maka disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).

Pertanyaan selanjutnya, apa itu fase diam dan fase bergerak?

Fase diam merupakan salah satu komponen penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi. Karena dengan adanya interaksi dengan fase diam terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit.

Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

Fase gerak merupakan pembawa analit, dapat bersifat inert maupun berintekrasi dengan analit tersebut.

Jika fase gerak merupakan gas, maka dikenal dengan kromatografi gas. Sedangkan pada HPLC, fase gerak yang digunakan adalah cair.

Hehehe, berikut sebuah teka-teki sederhana mengenai kromatografi 😉

Perhatikan Pengamatan di Bawah ini pada Pemisahan Uji Warna
Kolom kromatografi dengan panjang 20 cm diisi dengan suspensi silika dalam toluene. Setelah itu, sekitar 50-100 mL larutan zat warna (misalnya campuran uji warna II N dibuat oleh Camag, Muttenz, Swiss) adalah dibawa dengan cara suntik microliter dan toluene ditambahkan sebagai eluen.

Pengamatan
Berbagai pewarna bergerak pada tingkat yang berbeda melalui kolom. Senyawa yang cenderung berada di fase gerak bergerak lebih cepat daripada mereka yang di fase diam.

Koefisien Distribusi

Koefisien distribusi adalah distribusi dari molekul-molekul sample diantara dua fase ditentukan oleh tetapan kesetimbangan yang dikenal dengan koefisien distribusi K.

koefisien distribusi kromatografi

Keterangan:
Cs : Konsentrasi sampel dalam fase diam
Cm : konsentrasi sample dalam fase gerak

Faktor Kapasitas (Faktor Retention (k’))

Faktor kapasitas (k’) didefinisikan sebagai waktu tambahan yang diperlukan zat terlarut untuk terelusi, dibandingkan dengan zat yang tidak tertahan (k’ = 0), dibagi dengan waktu elusi dari zat yang tidak tertahan. Faktor kapasitas dinyatakan berdasarkan persamaan:

faktor kapasitas kromatografi

Keterangan:
Ns : Mol sample dalam fase diam
Nm : Mol sampel dalam fase gerak
Vs : Volume sampel pada fase diam
Vm : Volume sampel pada fase gerak

grafical kromatografi

Difusi Eddy

difusi eddy

Senyawa yang dipisahkan akan melewati kolom dengan jalan yang berbeda yang dapat menyebabkan terelusi dengan waktu yang berbeda (difusi eddy)

Variasi ini disebabkan oleh ukuran partikel dan pengemasan fase diam yang tidak homogen. Kontribusinya terhadap tinggi pelat teoritis:

menghitung difusi eddy

Untuk mengurangi difusi tersebut, dengan cara menggunakan kolom dengan ukuran partikel kecil.

Difusi Longitudinal

difusi longitudinal

Difusi longitudinal berpengaruh terhadap tinggi pelat, jika:

  • Partikel fase diam kecil.
  • Kecepatan fase gerak terlalu rendah dalam kaitannya dengan diameter partikel
  • Koefisien difusi sampel yang relatif besar.

Difusi ini dapat dikurangi dengan menggunakan laju alir fase gerak yang cepat.

Transfer Massa

transfer massa

Gambar di atas menunjukkan struktur pori partikel pada fase diam dimana saluran keduanya sempit dan lebar, beberapa partikel bisa tepat melalui seluruh partikel dan beberapa tidak. Pori-pori yang disini dengan fase gerak yang tidak bergerak. Molekul memasuki pori kemudian diangkut oleh pelarut fluks dan perubahan posisinya dengan cara difusi saja. Namun, dua kemungkinan muncul dengan sendirinya.

Hal yang Harus Diperhatikan dalam Pemilihan Kolom

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan kolom yaitu:

  1. Ukuran diameter partikel harus kecil. Rasio yang bagus antara 1,5 – 2 (contoh: ukuran partikel terkecil 5mm, terbesar 7,5 mm).
  2. Kecepatan aliran fase gerak harus dipilih sehingga difusi longitudinal tidak akan berpengaruh. Hal ini berlaku ketika u>2Dm = dp, dimana u adalah kecepatan aliran linear fase gerak, Dm koefisien sampel dalam fase gerak dan partikel dp diameter.
  3. Fase diam yang digunakan harus memiliki partikel-partikel kecil atau tipis, permukaan berpori.
  4. Menggunakan pelarut dengan viskositas rendah.
  5. Resolusi yang dihasilkan baik.

Kromatogram

kromatogram

Senyawa yang dielus diangkut oleh fase gerak ke detektor dan ditampilkan dalam bentuk kurva Gaussian. Sinyal dikenal sebagai puncak dan seluruh entitas adalah kromatogram.

Pada puncak memberikan informasi kualitatif dan kuantitatif.

Resolusi

resolusi

Resolusi adalah jarak antara dua puncak dibagi dengan rata-rata lebar puncak.

Keterangan:
(TR)B : Waktu retensi puncak B
(TR)A : Waktu retensi puncak A
WA : Lebar puncak A
WB : Lebar puncak B

Berikut adalah perkiraan resolusi dari pasangan puncak dari gambar di bawah ini.

perkiraan resolusi dari pasangan puncak

Berikut jenis-jenis resolusi yang kemungkinan muncul.

Resolusi yang baik adalah 1,5, minimum >1,25.

Faktor-Fakto yang mempengaruhi resolusi:

  1. Faktor pemisahan (∝)
  2. Jumlah pelat teoritis (N)
  3. Faktor retensi (k)

Berikut gambar resolusi yang kemungkinan muncul pada kromatografi.

Aduh … sekian dulu prinsip teori High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), puyeng lama-lama 🙂

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here